RNAi干扰靶标验证实验（shRNA）

　　实验介绍shRNA是short hairpin RNA 的缩写，包括两个短反向重复序列。将shRNA序列构建进shRNA干扰载体中，并将构建好的质粒转染进细胞中，经RNA聚合酶合成相应的shRNA。shRNA经Dicer酶消化后形成双链siRNA，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

 

　　服务项目

 

　　服务流程1、目的细胞待沉默基因表达量检测

 

　　2、干扰序列设计

 

　　3、根据序列构建三个shRNA干扰质粒，并做无内毒素质粒中提

 

　　4、如果在非工具细胞中检测，则需要进行转染预实验

 

　　5、shRNA转染

 

　　6、24小时后，qPCR检测目的基因表达情况，筛选合适的shRNA干扰质粒

 

　　最终提供 详细实验报告、shRNA干扰载体测序结果、质粒、甘油菌

 

　　样本要求待沉默的目的基因需在NCBI上能查到该物种所有转录组信息，否则无法验证设计的siRNA是否会沉默其它基因。

 

　　如果需要在特定细胞中进行实验，客户提供生长状况良好的细胞株，同时提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。

 

　　本公司常备DMEM(H)和RPMI-1640培养基，如细胞需要用其它培养基，则需要客户提供培养基。

 

　　需保证目的基因在该细胞中高表达，否则无法进行siRNA筛选验证实验。

 

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