荧光定量PCR检测

　　实验介绍实时荧光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）就是通过对PCR扩增反应中每一个循环时产物的荧光信号的实时监测从而实现对起始模板定量（即绝对定量PCR）及定性（即相对定量PCR）的分析，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化检测产物量的变化，并据此推断目的基因的初始量。绝对定量PCR不仅能测定目的基因在两个或多个样本中含量的相对比值，还能测定目的基因在每个样本中的具体拷贝数；相对定量PCR则只能测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，不能知道它们在每个样本中的拷贝数。依据目的基因检测难易度可进行TaqMan检测与SYBR检测，前者能准确区分单个碱基的差别获得最为准确的定量结果，但是其探针合成成分较高，而对于序列差别较大的基因，SYBR检测不仅准确更为廉价。

 

　　先进仪器： ABI系列仪器（ABI-Step One Plus qPCR仪、ABI-2720 PCR仪），高精度Eppendorf 8道电动移液枪

 

　　Stepone plus qPCR仪：具有时间省、灵敏度高、准确性好和线性范围宽等优点。

 

　　严格质控： 预实验检测引物与模板结合特异性，优化实验条件，并通过严格的对照实验保证结果准确性，样本全程干冰或液氮运输；保证三次重复的CT值≤0.5

 

　　顶级试剂： 顶级品牌Invitrogen等试剂、ABI原装PCR反应板和膜

 

　　服务流程： 核酸提取及质量分析、预实验条件优化、正式实验样品四次重复检测、实验报告包含数据分析、扩增曲线、融解曲线（注：公司提供仪器原始数据及软件，保证绝无修改）

 

　　样品要求：尽可能新鲜和足量的组织（＞50-100mg）、细胞样品106以上等，对于样本量很少或极少（25-105细胞或者约10mg组织），其他请事先咨询。

 

　　交付结果：实验报告，样本返还

 

　　质量保证：客观、公正、可信数据结果

 

　　交付时间：大约5-10个工作日（根据预实验、样本数量情况决定）

 

　　服务项目： 相对定量qPCR检测（SYBR Green/TaqMan探针法）及标准品制备

 

　　绝对定量PCR检测及标准品制备

 

　　qPCR引物设计合成、TaqMan探针法设计合成

 

　　服务流程1、 依据客户提供的基因ID或基因名称设计合成引物（含验证）

 

　　2、 标准品制备:只针对于绝对定量，相对定量多种内参可供选择（mRNA qPCR检测：β-actin，GAPDH或客户提供特异性内参；microRNA qPCR检测：以U6为内参）

 

　　3、 RNA提取及RNA质量分析：采用Invitrogen的TRIzol 进行裂解提取，RNA提取质量有琼脂糖凝胶电泳及分光光度计双重质控

 

　　4、 逆转录：严格按照fermentas的反转录试剂盒要求抽取质控合格的RNA，并且可提供oligo(dT)、随机引物、基因特异性引物以及混合引物几种模式进行反转录，以最大程度的确保反转录酶的反转效率

 

　　5、 预实验验证样品和引物：依据客户选定内参及基因，对客户全部样本内参及个别样本基因进行验证，以确保样本的反转录情况及基因的设计

 

　　6、 正式实验：在以上所有质控合格的情况下，每个样本每个基因进行四个复孔的重复检测，确保至少提供三个复孔Ct≤0.5的数据

 

　　7、 实验报告：提供详细的实验报告，包括RNA提取电泳图、扩增曲线、溶解曲线及数据结果分析

 

　　样本要求细胞（≥106个）：必须是活细胞，贴壁或悬浮均可

 

　　组织（≥50mg）:尽量新鲜并且切取之后立即置于液氮或-80℃保存

 

　　石蜡切片（≥10张）：厚度10-20μm，石蜡组织块或固定组织均可

 

　　全血（2ml以上）：抗凝管4℃运输，短期保存，分离后血清亦可

 

　　以上样本依据提取情况可进行1-10个基因的检测

 

　　留言咨询